Структура никезы ОМЕГА IsrB в комплексе с юРНК и ДНК-мишенью

May 06, 2023

Nature, том 610, страницы 575–581 (2022 г.) Процитировать эту статью

17 тысяч доступов

2 цитаты

107 Альтметрика

Подробности о метриках

Системы, управляемые РНК, такие как CRISPR-Cas, сочетают в себе программируемое распознавание субстратов с ферментативной функцией, и эта комбинация успешно использовалась для разработки мощных молекулярных технологий1,2. Структурные исследования этих систем пролили свет на то, как РНК и белок совместно распознают и расщепляют свои субстраты, что послужило руководством к рациональному проектированию для дальнейшего развития технологий3. Недавняя работа выявила новый класс РНК-управляемых систем, названный OMEGA, который включает IscB, вероятного предка Cas9, и никазу IsrB, гомолог IscB, лишенный нуклеазного домена HNH4. IsrB состоит всего лишь из 350 аминокислот, но его небольшой размер уравновешивается относительно большим РНК-гидом (примерно 300 нуклеотидов ωРНК). Здесь мы сообщаем о структуре Desulfovirgula thermocuniculi IsrB (DtIsrB) с помощью криогенной электронной микроскопии в комплексе с родственной ей ωРНК и целевой ДНК. Мы обнаружили, что общая структура белка IsrB имеет общий каркас с Cas9. Однако в отличие от Cas9, который использует долю распознавания (REC) для облегчения выбора цели, IsrB полагается на свою ωРНК, часть которой образует сложную тройную структуру, расположенную аналогично REC. Структурный анализ IsrB и его ωРНК, а также сравнение с другими РНК-ориентированными системами подчеркивают функциональное взаимодействие между белком и РНК, продвигая наше понимание биологии и эволюции этих разнообразных систем.

Белок IsrB, управляемый РНК, является членом семейства OMEGA, кодируемым суперсемейством транспозонов IS200/IS605. IsrB является вероятным предшественником IscB, другого члена семейства OMEGA, который является очевидным предком Cas9, о чем свидетельствуют как филогенетический анализ, так и общая уникальная архитектура домена4,5. Подобно IscB и Cas9, IsrB содержит RuvC-подобный нуклеазный домен, который прерывается вставкой мостиковой спирали (BH) (рис. 1а). Однако, в отличие от IscB и Cas9, у IsrB отсутствует нуклеазный домен HNH, доля REC и большие части домена, взаимодействующего с мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM), и, соответственно, он намного меньше (примерно 350 аминокислот), чем Cas9. . IsrB дополнительно содержит N-концевой домен PLMP (названный в честь его консервативного аминокислотного мотива) и нехарактерный C-концевой домен (рис. 1b). Предыдущая работа показала, что IsrB связывается с ωРНК длиной примерно 300 нуклеотидов, которая помогает IsrB разрывать нецелевую цепь двухцепочечной (ds) ДНК, содержащей мотив 5'-NTGA-3', смежный с мишенью (TAM)4. .

а — Архитектура локуса и направляющие РНК для IsrB (слева) и Cas9 (справа). б — Доменная архитектура Streptococcus pyogenes SpCas9 (вверху) и D. thermocuniculi IsrB (DtIsrB) (внизу). в — Схема IsrB в комплексе с ωРНК и целевой ДНК. Частичный дуплекс ДНК, содержащий ТАМ и целевые последовательности, использованные для структурного исследования, показан буквами последовательности. г, д, крио-ЭМ-карта плотности (г) и структурная модель (д) комплекса IsrB-ωРНК-ДНК-мишень. Пунктирные линии представляют плохо разрешенные области юРНК. TE, конец транспозона; ДР, прямой повтор; NUC, нуклеаза; PI — PAM-взаимодействующий; PLL, петля блокировки фосфата; ТИ, ТАМ-взаимодействующий; TS, целевая цепь; НТС, нецелевая цепь.

Чтобы охарактеризовать молекулярный механизм нацеливания ДНК с помощью ωРНК с помощью IsrB, мы проанализировали тройной комплекс, включающий Desulfovirgula thermocuniculi IsrB (DtIsrB), ωРНК длиной 284 нуклеотида, содержащую направляющий сегмент длиной 20 нуклеотидов, целевую цепь ДНК длиной 31 нуклеотид и 10 нуклеотидов. -nt нецелевую цепь ДНК с использованием одночастичной крио-ЭМ (рис. 1в). Мы получили трехмерную (3D) реконструкцию тройного комплекса с общим разрешением 3,1 Å (рис. 1d, расширенные данные, рис. 1a–c, и расширенные данные, таблица 1). Однако некоторые области карты, соответствующие ωРНК, были разрешены с более низким разрешением. Чтобы уточнить моделирование координат РНК, мы использовали инструмент моделирования, специфичный для РНК, auto-DRRAFTER, вместе с моделью вторичной структуры на основе ковариации для построения исходной модели ωРНК. На основе этой модели ωРНК и исходной модели IsrB, созданной путем предсказания структуры белка, мы определили структуру IsrB-ωРНК-ДНК (рис. 1e и расширенные данные, рис. 1d,e и 2)6,7,8.