11 мест, где можно приобрести материалы для поделок из дерева для вашего бизнеса
Apr 18, 202311 вещей, которые можно купить на распродаже в честь Дня памяти Лоу
Oct 02, 202325 подарков ко Дню отца от Lowe's, которые на самом деле очень практичны
May 10, 202325 подарков ко Дню отца от Lowe's, которые на самом деле очень практичны
Jul 08, 202325 подарков ко Дню отца от Lowe's, которые на самом деле очень практичны
Oct 21, 2023Структура никезы ОМЕГА IsrB в комплексе с юРНК и ДНК-мишенью
Nature, том 610, страницы 575–581 (2022 г.) Процитировать эту статью
17 тысяч доступов
2 цитаты
107 Альтметрика
Подробности о метриках
Системы, управляемые РНК, такие как CRISPR-Cas, сочетают в себе программируемое распознавание субстратов с ферментативной функцией, и эта комбинация успешно использовалась для разработки мощных молекулярных технологий1,2. Структурные исследования этих систем пролили свет на то, как РНК и белок совместно распознают и расщепляют свои субстраты, что послужило руководством к рациональному проектированию для дальнейшего развития технологий3. Недавняя работа выявила новый класс РНК-управляемых систем, названный OMEGA, который включает IscB, вероятного предка Cas9, и никазу IsrB, гомолог IscB, лишенный нуклеазного домена HNH4. IsrB состоит всего лишь из 350 аминокислот, но его небольшой размер уравновешивается относительно большим РНК-гидом (примерно 300 нуклеотидов ωРНК). Здесь мы сообщаем о структуре Desulfovirgula thermocuniculi IsrB (DtIsrB) с помощью криогенной электронной микроскопии в комплексе с родственной ей ωРНК и целевой ДНК. Мы обнаружили, что общая структура белка IsrB имеет общий каркас с Cas9. Однако в отличие от Cas9, который использует долю распознавания (REC) для облегчения выбора цели, IsrB полагается на свою ωРНК, часть которой образует сложную тройную структуру, расположенную аналогично REC. Структурный анализ IsrB и его ωРНК, а также сравнение с другими РНК-ориентированными системами подчеркивают функциональное взаимодействие между белком и РНК, продвигая наше понимание биологии и эволюции этих разнообразных систем.
Белок IsrB, управляемый РНК, является членом семейства OMEGA, кодируемым суперсемейством транспозонов IS200/IS605. IsrB является вероятным предшественником IscB, другого члена семейства OMEGA, который является очевидным предком Cas9, о чем свидетельствуют как филогенетический анализ, так и общая уникальная архитектура домена4,5. Подобно IscB и Cas9, IsrB содержит RuvC-подобный нуклеазный домен, который прерывается вставкой мостиковой спирали (BH) (рис. 1а). Однако, в отличие от IscB и Cas9, у IsrB отсутствует нуклеазный домен HNH, доля REC и большие части домена, взаимодействующего с мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM), и, соответственно, он намного меньше (примерно 350 аминокислот), чем Cas9. . IsrB дополнительно содержит N-концевой домен PLMP (названный в честь его консервативного аминокислотного мотива) и нехарактерный C-концевой домен (рис. 1b). Предыдущая работа показала, что IsrB связывается с ωРНК длиной примерно 300 нуклеотидов, которая помогает IsrB разрывать нецелевую цепь двухцепочечной (ds) ДНК, содержащей мотив 5'-NTGA-3', смежный с мишенью (TAM)4. .
а — Архитектура локуса и направляющие РНК для IsrB (слева) и Cas9 (справа). б — Доменная архитектура Streptococcus pyogenes SpCas9 (вверху) и D. thermocuniculi IsrB (DtIsrB) (внизу). в — Схема IsrB в комплексе с ωРНК и целевой ДНК. Частичный дуплекс ДНК, содержащий ТАМ и целевые последовательности, использованные для структурного исследования, показан буквами последовательности. г, д, крио-ЭМ-карта плотности (г) и структурная модель (д) комплекса IsrB-ωРНК-ДНК-мишень. Пунктирные линии представляют плохо разрешенные области юРНК. TE, конец транспозона; ДР, прямой повтор; NUC, нуклеаза; PI — PAM-взаимодействующий; PLL, петля блокировки фосфата; ТИ, ТАМ-взаимодействующий; TS, целевая цепь; НТС, нецелевая цепь.
Чтобы охарактеризовать молекулярный механизм нацеливания ДНК с помощью ωРНК с помощью IsrB, мы проанализировали тройной комплекс, включающий Desulfovirgula thermocuniculi IsrB (DtIsrB), ωРНК длиной 284 нуклеотида, содержащую направляющий сегмент длиной 20 нуклеотидов, целевую цепь ДНК длиной 31 нуклеотид и 10 нуклеотидов. -nt нецелевую цепь ДНК с использованием одночастичной крио-ЭМ (рис. 1в). Мы получили трехмерную (3D) реконструкцию тройного комплекса с общим разрешением 3,1 Å (рис. 1d, расширенные данные, рис. 1a–c, и расширенные данные, таблица 1). Однако некоторые области карты, соответствующие ωРНК, были разрешены с более низким разрешением. Чтобы уточнить моделирование координат РНК, мы использовали инструмент моделирования, специфичный для РНК, auto-DRRAFTER, вместе с моделью вторичной структуры на основе ковариации для построения исходной модели ωРНК. На основе этой модели ωРНК и исходной модели IsrB, созданной путем предсказания структуры белка, мы определили структуру IsrB-ωРНК-ДНК (рис. 1e и расширенные данные, рис. 1d,e и 2)6,7,8.